回答下列基因工程的有关问题。

（1）步骤①和②中常用的工具酶是               和               。
（2）质粒的基本组成单位是                  。上图中质粒上有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因两个标记基因，经过①和②步骤后，有些质粒上的                    基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。
（3）步骤③是                                        的过程，为了促进该过程，应该用                处理大肠杆菌。
（4）步骤④：将锥形瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基C上培养，能在C中生长的大肠杆菌有                种。
（5）步骤⑤：用无菌牙签挑取C上的单个菌落，分别接种到D（含氨苄青霉素和四环素）和E（含四环素）两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于            （填D或E）上，请在图中相应的位置上圈出来（标在答题纸相应位置）。