下图为大肠杆菌的试验过程，据图回答下列问题：

（1）步骤①和②中常用的工具酶是________________和__________________。
（2）图中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个标记基因，经过①和②步骤后，有些质粒上的______________________基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基 
因的分隔使得该抗性基因失活。
（3）步骤③是_________________________________________的过程，为了促进该过程，应该用_________________处理大肠杆菌。
（4）步骤④：将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基C上培养，目的是筛选_______________，能在C中生长的大肠杆菌有________种。
（5）步骤⑤：用无菌牙签桃取C上的单个菌落，分别接种到D（含氨苄青霉素和四环素）和E（含四环素）两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于___________（填D或E）上，请在图中相应的位置上圈出来。