内共生假说认为，线粒体起源于在厌氧真核细胞中共生的需氧细菌。研究人员将经过改造的大肠杆菌导入相应的专性厌氧酵母细胞质中构建共生体，为上述假说提供证据。

（1）获得专性厌氧呼吸的酵母菌株

利用基因敲除技术破坏酵母菌_____的功能，导致该细胞器不能产生ATP。

（2）获得维生素 $B_1$ 营养缺陷且能分泌ATP的大肠杆菌菌株

①利用基因敲除技术获得维生素 $B_1$营养缺陷型大肠杆菌菌株A。

②构建含有ATP转运蛋白基因 $X$的质粒2。

已知在基因 $X$ 质粒1上均无 $EcoRⅠ$和 $NotⅠ$酶切位点。研究者采用引物P1（含 $EcoRⅠ$识别序列）和P2（含 $NotⅠ$识别序列）对基因X进行扩增，并采用引物P3（含 $EcoRⅠ$识别序列）和P4（含 $NotⅠ$ 识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使基因 $X$与质粒1重组为质粒2．请在下图质粒1处标出引物P3和P4的位置及方向。

③将质粒2转入菌株A中，筛选获得菌株B。

（3）采用下图所示过程将菌株B导入步骤（1）获得的酵母菌中，筛选获得融合菌株

促进膜融合的化学试剂通常选择_____。大肠杆菌细胞壁为双层结构，内层为坚固的肽聚糖，外层为脂质双分子层膜结构。融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的_____。

在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上筛选到能够增殖的融合菌株，其中酵母菌为大肠杆菌提供_____，大肠杆菌为酵母菌提供_____，表明二者建立了互利共生关系。在筛选融合菌株时，不能用葡萄糖为碳源，原因是：_____。