基因工程和植物细胞工程技术在科研和生产实践中有广泛应用，请据图回答：
(1)获取目的基因的方法包括________（答一种即可）和用化学方法直接人工合成。
(2)基因表达载体的组成除目的基因外，还必须有_________和标记基因。
(3)①②过程采用最多的是农杆菌转化法，原因是农杆菌中Ti质粒上的，可转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，检测目的基因是否翻译成蛋白质的方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行______。
(4)图中③④过程须在无菌条件下进行，培养基中除加入营养物质外，还需添加________等物质，作用是促进细胞分裂、生长、分化。
(5)若要获取转基因植物人工种子，需培养到_______阶段，再进行人工种皮的包裹；如用植物细胞实现目的基因所表达的蛋白质类药物的工厂化生产，培养到________阶段即可。
(6)从含有目的基因的受体细胞发育成完整的植物体依据的原理是________。
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄目动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。此疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VPI。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过程如下图所示。请据图回答。
(1)口蹄疫病毒的VPI蛋白在免疫反应中称之为 ；口蹄疫基因在植物体细胞中也能表达出相同产物的原因是 。
(2)过程⑥的培养基中除了加入各种必需营养物质和植物激素外，还需要添加卡那霉素以便筛选出含有
的叶片小段。
(3)在制作含有VPI基因的表达载体时，所选用的载体中有限制酶E、F,G、H的切点各一个。若用两种识别切割序列完全不同的限制酶E和F从含有VPI目的基因的DNA上进行切割，并将之取代质粒pZHZ1(3．7kb，lkb＝1000对碱基)上相应的E—F区域(0．2kb)，图解如下图2。若再用限制酶G和H各切割一份重组质粒pZHZ2样品，酶切结果如表1所示，试判断VPI目的基因的大小为 kb，酶G和酶H都能将重组质粒切割出两段的原因是 。
(4)获得表达VPI蛋白的番茄植株以后，需要进行免疫效力的测定。具体方法是：将转基因番茄叶片提取液注射到豚鼠体内，每半个月注射一次，三次后检测豚鼠血液内产生的 的量。为了使相应的结论可信，应增设两个对照组，分别注射 和 。
逆转录病毒载体是一种表达型质粒，结构如图所示。图上的“逆转录病毒序 ”可以整合到动物细胞的染色体上，不 断地表达其携带的目的基因，获得大量重 组逆转录病赛。（E、F、H分别为限制酶 E、F、H的酶切位点）。
(1) 逆转录的模板是_____,原料是_____。
(2) 在构建重组质粒时，目的基因插入该质粒，此过程需要的酶是限制酶____和____0
(3) 将重组质粒转人大肠杆菌前用某种离子处理大肠杆菌使之成为_______才能完成转化过程。为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_______的培养基进行培养。
(4) 获取大量重组质粒后,可培育转基因小鼠，将重组质粒转入导人小鼠原核期受精卵的方法是_______。若目的基因进人细胞后插入在一条染色体DNA上，那么获得转基因纯合子小鼠的方法是______________。
图l、图2力获得生物新品种的过程示意图。请据图回答
（1）图2为获得抗虫棉技术的流程。A过程需要的酶有 。图3为重组质粒的模式图，B过程在一般培养基中应加入 ，才能获得含重组质粒的土壤农杆菌。
（2）图2中将目的基因导入植物受体细胞采用的方法是____。C过程的培养基除含有必要营养物质外，还必须加入的激素是____。
（3）随着科技发展，获取目的基因的方法也越来越多，若图2中的“抗虫基因”是利用图l中的方法获取的，该方法称为 、 。图中①过程与细胞中DNA复制过程相比，该过程不需要____酶。
（4）离体棉花叶片组织经C、D、E成功地培育出了转基因抗虫植株，此过程涉及的细胞 工 程技术是____。
大豆是两性花植物。 大豆子叶颜色（BB表现为深绿色；Bb表现为浅绿色；bb表现黄色，bb在幼苗阶段即死亡）和花叶病的抗性（由R、r基因控制）遗传的实验结果如下表：
| 杂交 组合 |
父本 |
母本 |
F1的表现型及株数 |
|||
| 深绿抗病 |
深绿不抗病 |
浅绿抗病 |
浅绿不抗病 |
|||
| 一 |
浅绿抗病 |
深绿不抗病 |
220 |
0 |
217 |
0 |
| 二 |
浅绿抗病 |
深绿不抗病 |
110 |
109 |
108 |
113 |
请分析回答：
（1）从上表杂交组合 可推断出抗病对不抗病性状是 （显、隐）性。
（2）这两对性状的遗传遵守基因的 定律。组合二中父本的基因型是 。
（3）如果用杂交组合一中的父本自交得到F1，则在F1的成熟植株中，浅绿抗病类型占 。
（4）有人想利用细菌的抗病毒基因对不抗病毒的大豆进行遗传改良，以获得抗病毒大豆品种。将外源抗病毒基因导入大豆，这项基因工程技术的核心步骤是 ，利用 技术可以获得大量的目的基因。
（5）上述的这种育种方法与传统的杂交育种方法相比，最显著的优点是 。
利用玉米秸秆生产乙醇,其技术流程为：
(1) 玉米秸杆经预处理后，应该选用纤维素酶进行水解，使之转化为发酵所需的葡萄糖。 纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌培养液中提取。某同学设计了如下分离土壤中 纤维素分解菌的实验流程:土壤取样→选择培养—梯度稀释→鉴别培养。
①从土壤中分离出分解纤维素细菌的培养基配方如下：纤维素粉5g, NaNO3 1g、 Na2HPO4 • 7HZ0 1.2g、KH2PO4 0.9 g,MgS04·7H20 0.5g、K Cl 0.5g、酵母膏0.5g、水解酪素0.5g(蒸馏水定容到IOOOmU9该培养基能初步选择出分解纤维素细菌的原因是______________
②为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴别培养基上加入_______染液，将筛选获得的菌液稀释后用涂布平板法方法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生_______的菌落作为菌种进行扩大培养。
③从分解纤维素细菌中提取出的纤维素酶首先要检测____________________________，以便更好地将酶用于生产实践。为了使分离出的纤维素酶能够反复使用，最好采用_____________________或_____________________方法将酶固定化。
(2) 发酵阶段需要的菌种是酵母菌，在产生酒精时要控制的必要条件是______________。
(3) 发酵时乙醇浓度升高会对酵母菌产生毒性,从而影响进一步的发酵。科学家利用基 因工程方法创造出一种对乙醇浓度有高耐受力的酵母菌新菌种，该过程需采用PCR 技术扩增目的基因。在PCR反应体系中，除了要加入模板、原料外，还需要加入_______和_______等
请回答下列有关胚胎工程和基因工程的问题：
(1)将胚胎干细胞置于子宫内发育成一个个体，体现了胚胎干细胞具有 。将早期胚胎分割、移植可获得多个同卵胚胎，这属于动物的 方法。
(2)利用造血干细胞可以治疗白血病，造血干细胞移植之前先要进行培养。动物细胞培养一般分为 和
两个阶段，和植物细胞培养不同的是，培养时除需要适宜的温度、无菌、无毒等环境条件以外，营养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、核苷酸，还要加入 ；向培养液中通入95%氧气和5%二氧化碳，氧气参与细胞的代谢，二氧化碳可以维持培养基的 。
(3)目的基因的表达与鉴定是基因工程的重要环节。用 法可以在分子水平上检测是否翻译成了相应蛋白质。用实施基因工程的小麦做抗虫或抗病的接种实验，若仍患病，则必须再对 进行改造或修饰，重新进行基因工程的操作。
水稻是广东省的主要粮食作物，也是科研人员常用的研究材料。
（1）为培育出含β胡萝卜素的“黄金大米”，科研人员提出以下两套培育方案：
在甲方案的操作步骤中最关键的步骤是_______。在乙方案中诱导细胞融合的常用化学试剂是_______。上述两套培育方案的共同优点是能克服_______。
（2）为研究转基因水稻与普通水稻混合种植后的生长情况，某研究小组设计了以下实验，请完善。
①选取面积和水肥条件均相同的5块试验田。
②将转基因水稻种子和普通水稻种子按不同比例进行播种（从全部为转基因水稻种子到全部为普通水稻种子），5块实验田中两者的比例依次分别为：0:1、_______、0.5:0.5、0.75:0.25、1:0。
③按上述比例在每块试验田中随机并均匀播种1000粒种子，在各项种植条件均_______的情况下，种植至收获种子。
④统计各试验田中所收获的转基因水稻种子和普通水稻种子的数目。此外，也可根据_______（至少写出两个）等指标比较不同试验田中水稻的生长情况。
试验结束后，废弃的水稻试验田重新长出灌木丛，这属于_______演替。与水稻田相比，灌木丛的_______稳定性较强。
利用“基因敲除”技术，能“敲除”DNA上的特定基因。该技术的主要过程示意图如下：
(1)胚胎干细胞可从小白鼠的____________________中分离得到。
(2)neoR基因插入靶基因使用的工具酶是______________和______________,前者识别特定脱氧核苷酸序列并在特定位点切开。“靶基因失活”的含义是_____________________________________________。
(3)失活靶基因与正常靶基因互换涉及的变异类型是______________；处理后的胚胎干细胞，转移到特定培养基中筛选培养。“特定培养基”中需加入__________以能起到筛选培养的目的。
(4)科学家可以通过“基因敲除”来研究基因的功能，培养图示中胚胎干细胞所获得的“基因敲除”小白鼠__________(填“能”或“不能”)直接用于研究基因功能，原因是______________________________。
人们应用生物工程技术可以获得所需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题：
（1）获得抗虫基因的常用方法是 ，然后利用 进行大量扩增。
（2）转基因牛可通过分泌乳汁来生产人生长激素，在基因表达载体中，人生长激素基因的首端必须含有 。③过程培养到桑椹胚或囊胚阶段，可以用 技术，培育出多头相同的转基因牛犊。
（3）PrG基因的产物能激发细胞不断分裂，一般采用 技术将无限增殖基因导入 细胞中。
（4）在抗虫棉培育过程中，将目的基因导入棉花受体细胞采用最多的方法是 法。⑤过程采用的技术是 。
口蹄疫是由RNA病毒引起的一种偶蹄动物传染病。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗（主要成分：该病毒的一种结构蛋白VP1），过程如图所示。请据图回答下列问题：
（1）在上述实验过程中所涉及的生物技术工程有_________、_________，如图所示②成功构建重组质粒的过程中，需要用到的工具有_________ 和_________。
（2）⑤过程代表的是_________，经过该过程形成的细胞具有_________特点，⑥过程中重要的两种植物激素是_________和_________。
（3）⑥培养基中添加_________可筛选能表达疫苗的细胞；检测转化成功的蕃茄植株,除检测标记基因产物外，还可采用_________技术检测目的基因在蕃茄体内是否转录。
（4）该过程运用原理有_________ 、_________ 等。
（5）在该过程中，研究人员首先获取了目的基因，并采用____技术对目的基因进行扩增，该技术需要的条件是_________、酶、dNTP、模板；然后构建基因表达载体。基因表达载体中除了具有目的基因、启动子和终止子之外，还需具有____________。
回答下列关于基因工程的问题。
草甘膦是一种广谱除草剂，其除草机制是抑制植物体内EPSPS酶的合成，最终导致植物死亡。但是，它的使用有时也会影响到植物的正常生长。目前，已发现可以从一种抗草甘膦的大肠杆菌突变株中分离出EPSPS基因，若将该基因转入植物细胞内， 从而获得的转基因植物就能耐受高浓度的草甘膦。
下图A-F表示6株植物，其中，植物A和D对草甘膦敏感，B和E对草甘膦天然具有抗性，C和F则经过了转基因处理，但是是否成功还未知。图1和2分别表示两段DNA序列。表格中1-4分别表示4种限制性核酸内切酶的酶切位点。据图回答下列问题：
（1）若A-C浇清水，D-F浇的水中含有草甘膦，上述植物中，肯定能健康成长的是_________。
（2）若要从大肠杆菌中筛选出含EPSPS基因的突变菌株甲，在大肠杆菌培养基中还必须加入 ___________。
（3）假设位于EPSPS基因两侧的DNA序列均如图1所示，则应选择表中酶__________进行酶切；若位于EPSPS基因两侧的DNA序列分别如图1和2所示，则应选择表中酶__________ 进行酶切。
（4）假设大肠杆菌突变菌株甲中EPSPS基因的右侧序列如图2所示，请在方框内画出经酶切后产生的两个末端的碱基序列。
（5）假设EPSPS基因已被成功转移到植物F中，但植物F仍没有表现出抗性，分析可能的原因_____________。
下图甲是某目的基因（4.0kb，1kb=1000对碱基）与大肠杆菌pUC18质粒（2.7kb）重组的示意图。图中Ap′是抗氨苄青霉素基因，lacZ是显色基因，其上的EcoRI识别位点位于目的基因插入位点的右侧，其控制合成的物质能使菌落呈现蓝色。（图乙中深色圆点即为蓝色菌落）
（6）图乙的培养基中含有氨苄青霉素，请判断图乙中所出现的白色和蓝色两种菌落中，何种会含有重组质粒。___________。
（7）现用EcoRI酶切质粒，酶切后进行电泳观察，若出现长度为_________kb和 kb的片段，则可以判断该质粒已与目的基因重组成功。（重组质粒上目的基因的插入位点与EcoRI的识别位点之间的碱基对忽略不计）
分析回答下列Ⅰ、Ⅱ题
Ⅰ罗非鱼是杂食性鱼类，在珠江三角洲地区大量养殖，能适应咸、淡水环境。
（l）当罗非鱼由淡水进入咸水，机体会大量脱水，细胞外液渗透压 ，渗透压感受器产生兴奋，并将兴奋传给____ ，促使其释放 ，该物质的作用是 。
（2）某实验基地水库中放养了一批罗非鱼。其监测数据显示，a~e段这种罗非鱼的种群数量发生了明显波动，调查发现有人在该水库中放生了大型肉食性鱼（FNE）；一段时间后，罗非鱼种群数量达到了相对稳定状态（见图9）。图中显示，罗非鱼种群在a~b段呈 型增长。据图可知，FNE进入水库后，在捕食压力下，罗非鱼种群的环境容纳量接近 。
（3）富营养化导致藻类大量繁殖，该水库出现水华现象，浮游动物和鱼类均受到影响。请用文字和箭头描述藻毒素从产毒藻逐级积累到FNE体内的途径。
Ⅱ图l表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题
（1）限制性核酸内切酶的酶切点是连接两个核苷酸之间的 。
（2）若用限制酶Smal完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。
（3）若图l中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，产物中共有 _____种不同长度的DNA片段。
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是____ 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，请你设计一个筛选方案： 。
I. (13分)人类Y染色体虽有强烈的男性化作用， 但其作用不是绝对的。有些XY型个体体内有睾丸，但其体型与外生殖器的表现型却为女性，称为“睾丸女性化”。 通过研究发现“睾丸女性化”是X染色体上某一基因突变 引起的遗传病(等位基因用T、t表示）。下图为“睾丸女性化”患者的一个家系，据图请回答下列问题：
(1) 根据系谱图中______个体的表现型可判断“睾丸女性化”为______ (填“显性”或“隐性”)遗传病。
(2) I1和II1个体的基因型依次为______、______；理论上I1和I2所生子女的性别表现及比例为____________o
(3) 若IV1与正常男性婚配，其所生子女中出现“睾丸女性化”患者的概率为______。
(4) 研究表明T基因编码睾丸酮受体蛋白，t基因无此项编码功能，睾丸酮决定男性第二性征的 出现，试从分子水平解释“睾丸女性化”的病因______
(5) “睾丸女性化”遗传病的研究表明人类第二性征出现的根本原因是与______有关。
II. O分)为了研究高血压的患病机理，某科研机构将通过逆转录方法获得的高血压相关基因 转移到大鼠体内，具体流程如下图所示，请据图分析回答下列问题：
（1）要用同一种______处理高血压相关基因和质粒，以获得相同的______。质粒作为运载体，其基因结构中高血压相关基因的首端必须有______；质粒还必须具有______，以检测重组质粒是否导人了受体细胞；图示过程中，高血压相关基因导入受体细胞一般采用的方法是____________。
（2）将受精卵发育成的早期胚胎通过______技术转移到代孕母体的子宫内孕育成转基因大鼠，此前需要用激素对代孕母体进行______处理。
（3）检测髙血压相关基因是否表达的方法有分子水平的检测和个体水平的检测，分子水平的检 测方法是______，个体水平的检测方法是______。
下图是培养生产药物的乳腺生物反应器转基因动物的过程，请完成下列各题。
（1）研究表明，在共转染中，能够摄入DNA的哺乳动物细胞，可将两种互不相连的质粒能以很高的频率(>90%)摄入细胞。由此可以认为，图中共转染过程能够将 基因和目的基因同时导入同一个细胞。②中是根据 基因表达的性状筛选出的细胞。
（2）①是含有人凝血因子Ⅸ基因的质粒，在基因工程中该分子依据所起到作用被称为 。为了使凝血因子Ⅸ基因在羊恰当的细胞中表达，a片段应为羊 启动子，其是 识别和结合的位点。
（3）从白脸羊体内分离出的细胞要经过胰蛋白酶或 酶处理再进行培养，培养时要考虑 的环境；营养；温度、pH和 环境等外部条件。
（4）③表示 细胞，⑥表示的胚胎是 。图中电激的作用是促进 。
（5）⑥在受体母羊子宫内正常发育的生理基础是：第一，受体为胚胎提供正常发育的生理环境；第二，受体对移入子宫的胚胎基本上不发生 反应；第三，供体胚胎可与受体子宫建立正常的 联系。
试题篮
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