请分析下面一项专利。
| 申请专利号 |
03109739.1 |
时间 |
2003.04.14 |
| 名称 |
利用转基因番茄生产胰岛素的方法 |
公开号 |
1458161 |
| 公开日 |
2003.11.26 |
申请（专利权） |
林忠平 |
| 地址 |
北京市北京大学 生命科学学院 |
发明（设计人） |
林忠平、倪挺、 陈溪、胡鸢雷 |
| 专利 摘要 |
本发明利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素。所用的人胰岛素基因是依据植物偏爱密码子的原则来设计所含的密码子，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在C端加上KDEL的内质网滞留序列。将该基因置于CaMV35S启动子和果实专一性启动子2A12的驱动之下，通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素。 |
⑴此基因工程中，目的基因是 。将人工合成的DNA片段拼接在一起，所必需的工具酶是 。
⑵试分析在C端加上KDEL的内质网滞留序列的原因：
。
⑶用目的基因与农杆菌的 结合构建表达载体。目的基因能否在番茄中稳定遗传的关键是 ，检测受体细胞中是否存在目的基因可采用 技术。
（选修3·《现代生物科技专题》）随着科学技术的发展，人们可以根据需求改造生物的性状，在许多领域取得了可喜的成果，下图是利用奶牛乳汁生产人类血清白蛋白的图解，请根据下图回答：
（1）在此工程过程中涉及到的现代生物技术主要有： （至少写出三项）。
（2）在基因工程中，在②进入③之前要用 和（运）载体等工具来形成重组DNA分子。目前将目的基因导入动物细胞最常用的方法是 。
（3）图中①一般经 处理可以得到③。
（4）从下列A～D中选出④到⑤的过程中J下确的操作方法是 。
（5）⑦是⑥生出的后代，那么⑦的遗传性状和 最相拟，因为 。
如果②的数量太少常用 技术来扩增。要实现⑦批量生产血清白蛋白，则要求③的性染色体是 。
人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，其疫苗生产和抗体制备的流程图如下。请回答：
（1）过程②代表的是基因工程操作步骤中_________________。基因工程的核心步骤是_______（填序号）
（2）过程⑤采用的实验技术是_________________，获得的X是_________________。
（3）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的____________所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行核酸（基因）序列比较，或用图中的_________________________________进行特异性结合检测。
（4）单克隆抗体与常规的血清抗体相比,最主要的优点是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
下图为某遗传系谱图，系谱图中有患甲病（基因A、a）、乙病（基因B、b）和甲乙两病兼患者。II7无乙病家族史。请回答以下问题（概率用分数表示）。
（1）甲病的遗传方式为 。
（2）乙病的遗传方式为 。其遗传特点 。
（3）Ⅲ-2的基因型及其概率为 。
（4）由于Ⅲ-3个体表现两种遗传病，其兄弟Ⅲ-2在结婚前找专家进行遗
传咨询。专家的答复是：正常女性人群中甲、乙两种遗传病基因携带者的概率分别为1/10000和1/100；如果婚后生下的是男孩则表现甲、乙两种遗传病的概率分别是_________。
（5）在该系谱图中，编号为 的个体与该家谱图中的其他个体均无近亲关系。
（6）若对I-1、I-2、Ⅱ-1、Ⅱ-2进行关于甲病的基因检测，将含有患病基因或
正常基因的相关DNA片段（数字代表长度）进行分离，结果如下图。（a、b、c、d代表上述个体）请回答：
①长度为 单位的DNA片段含有患病基因。
②个体d是系谱图中的 号个体。
下图表示应用基因工程技术获得人们需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题：
（1）在培育转人生长激素基因牛过程中，①过程必需的工具酶主要是 和 ，①过程中必需的酶作用于图7中的 处（填“a”或“b”）
（2）转人生长激素基因牛分泌的乳汁中含人生长激素，③过程培养到桑椹胚或囊胚阶段，可以采用_____________技术，培育出多头相同的转基因牛。
（3）prG能激发细胞不断分裂，向Ⅱ中导入该基因可以用来制备单克隆抗体，Ⅱ最可能是
细胞，Ⅲ代表的细胞具有 的特点。此外，还可以让Ⅱ与
细胞融合，形成的细胞也能用来制备单克隆抗体。
（4）在抗虫棉培育过程中，⑤采用的技术是 。
（5）图8 中A－D段表示质粒的某基因，阴影区的长度相当于mRNA的长度。B表示与RNA聚合酶结合位点
。请在图上方的方框内用箭头表示出RNA聚合酶在C上的移动方向。为使目的基因直接表达，目的基因插入的最佳位点是图中的_________处。（填数字序号）
下图（一）为某基因工程中利用的质粒简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素（抗生素）抗性基因，tctR为四环素（抗生素）抗性基因。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。下图（二）为几种酶作用于基因的位置。请回答下列问题：
（1）在基因工程中常用的工具有三种：一是用作切取目的基因的 酶；二是将目的基因与运载体拼接的 酶；三是作为运载体的质粒。
（2）将含有目的基因的DNA与经特定的酶切后的运载体（质粒）进行拼接形成重组DNA，理论上讲，重组DNA可能有：目的基因－目的基因、目的基因－运载体和运载体－运载体三种，其中有效的（所需要的）重组DNA是 ，因此需要对这些拼接产物进行分离提
纯。
（3）利用图（一）所示的质粒拼接形成的3种拼接产物（重组DNA）导入无任何抗药性的原核宿主细胞，并接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的拼接产物（重组DNA）是 。含有效的重组基因（目的基因-运载体）的原核宿主细胞在含青霉素的培养基上_________（能/不能）生长。
（4）在动物基因工程中，将重组DNA导入受体细胞的常用方法
是 。
（5）图（二）中，作用于a 位置的酶是 ；作用于b 位置的酶是 。
下图一是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。
（1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程并说明理由。＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（2）若A中共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，则③④⑤过程连续进行4次，至少需要提供胸腺嘧啶＿＿＿＿＿个。
（3）如下图二是运载体和胰岛素基因的某个片段，已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。GeneI和 GeneII为标记基因，根据图示判断能否用限制酶Ⅱ切割质粒？为什么？＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（4）为使过程⑧更易进行，可用＿＿＿＿＿＿＿＿（药剂）处理D。通过图一方法生产的胰岛素可能不具备生物活性，为什么？＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（5）人的基因能能在大肠杆菌中表达，是因为＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（6）利用转基因牛、羊乳汁提取药物工艺简单，甚至可能直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛羊尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
美国及日本两个研究团队的报告中证实皮肤细胞经过“基因直接重组”后可以转化成为具有胚胎干细胞特性的细胞。这项发现解决了利用胚胎进行干细胞研究的道德争议，另一方面也使得干细胞
研究的来源更广泛。请回答下列有关问题。
（1）人类的胚胎发育过程中，细胞分化开始于＿＿＿＿阶段。
（2）胚胎工程中的胚胎移植实际上是生产胚胎的＿＿＿＿和孕育胚胎的＿＿＿＿共同繁殖后代的过程。
（3）美日科学家利用病毒分别将四个基因导入皮肤细胞，促使普通的反肤细胞产生变化，最后成为带有胚胎干细胞性质的细胞。在基因工程中，这四个基因称为＿＿＿＿＿，病毒称为＿＿＿＿，在基因工程中常用的工具酶有＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（4）如果要在体外大量复制这四个基因，应使用的技术为＿＿＿＿＿，在此过程中用到的酶为＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
降钙素是一种多肽类激素，临床上用于治疗骨质疏松症等。人的降钙素活性很低，半衰期较短。某科研机构为了研发一种活性高、半衰期长的新型降钙素，将能人工合成降钙素的DNA与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。据图回答：
（1）图1示人工合成降钙素DNA的过程。从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了两条72个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA。从功能看，Klenow酶是一种___________酶，合成的双链DNA有________个碱基对。
（2）图2示利用基因工程获得产品的过程。获取目的基因的方法除图2显示的方法外还有 。
（3）对图2中a点的操作方法为 。
（4）获得的双链DNA经酶切后插入到大肠杆菌质粒中，筛选含重组质粒的大肠杆菌并进行DNA测序验证。
1）大肠杆菌是理想的受体细胞，这是因为它__________________________________。
2）要进行重组质粒的鉴定和选择，大肠杆菌质粒需要含有_______________。
（5）对符合设计要求的重组质粒进行酶切，已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC— ，限制酶II的识别序列和切点是—↓GATC—。仔细读图判断质粒用_____
切割。
请就基因表达及其模式的相关研究分析回答：
（1）图1是运用标记的基因单链作探针检测到的人3种细胞中4种基因及其活性状态。基因是否有活性是指能
否被转录成RNA。
1）用探针检测基因是否有活性依据的基本原理是_______________________。
2）图1显示在所有代谢的细胞中都有活性的基因是________________，其表达产物的合成和发挥作用的场所分别是_________________。细胞A的名称是_______________，其产生的特殊蛋白质如果不足则会使人出现______________________等增多的现象。
（2）图1结果说明不同类型的细胞表达不同的基因组合。那么不同类型的动物
细胞都具有全套基因吗？科学家进行了如图2的克隆研究。Ⅰ~Ⅶ代表有关过程，a~h代表有关结构或个体。
1）图2中，证明供体细胞的核具有全能性的过程是Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→________________（填标号）；a细胞的名称是____________。过程Ⅴ取出的细胞f是________________，该细胞经过Ⅶ过程分化成何种h细胞取决于培养基中加入的_______________________。
2）若g是能产生人生长激素的羊，则无需图中的Ⅰ过程，对b的操作方法通常是______
____________。为了尽快获得大量的生长激素，但让g进行有性生殖会丢失目的基因，你将通过_____________________________技术来实现之。
下图表示用显微注射法导入目的基因获得转基因鼠的过程，据图回答。
（1）培育转基因哺乳动物时，与用早期胚胎细胞作受体细胞相比，受精卵的优势是_______
___________________。
（2）受精卵可以从供体母鼠体内获得，也可以通过体外受精获得。
①若受精卵细胞从供体母鼠体内获得，其基本过程是：首先对供体母鼠用促性腺激素进行__________处理，再通过自然交配或___________完成受精，最后从供体母鼠输卵管中获得受精卵细胞。
②若受精卵通过体外受精，基本操作过程包括________________、__________________和受精。
（3）过程Ⅲ表示受精卵经过体外培养，形成早期胚胎，再移植到受体母鼠体内。培养过程中，培养液添加一定量的_________，以防止杂菌污染；可通过________，以便清除代谢产物。
（4）用显微注射技术将目的基因导入受体细胞，需要构建基因表达载体吗？为什么？
_____________________________________________________________________________
真核细胞的基因由编码区和非编码区两部分组成（如下图一示），其中编码区包括能够编码蛋白质的序列（外显子）和一般不能够编码蛋白质的序列（内含子）。在真核细胞基因表达时，首先由DNA转录出前驱ｍRNA，然后经过裁接（将内含子的转录部分切除并将外显子的转录部分连接起来）才能形成成熟的ｍRNA。但在裁接时有可能会发生选择性裁接（在裁接时可能会同时切除某一个或几个外显子的转录部分，即形成不同的裁接形式）和RNA编辑（将前驱ｍRNA上的核苷酸序列加以修改，包括碱基置换或碱基增减）。选择性裁接和RNA编辑的存在，进一步增加了蛋白质结构和功能的多样性。请分析回答
（1）写出遗传信息的传递和表达过程图式： 。
（2）由于DNA分子的双链靠碱基之间的的氢键相结合，因而增强了DNA分子结构的稳定性。下列双链DNA结构在复制
时，最不容易解旋的是（ ）
A、
B、
C、
（3）选择性裁接和RNA编辑作用发生在细胞中的 （部位）。
（4）人的apoB基因在肝细胞中表达出apoB－100蛋白质（数字表示该蛋白质含有的氨基酸数），但是在小肠细胞中， apoBｍRNA上靠近中间位置的某一个“－CAA”密码子上的“C”被编辑为“U”，因此只能表达出apoB－50蛋白质。则下列有关分析中正确的是（ ）（不定项选择）
A、apoB基因含有606个脱氧核苷酸；
B、apoB基因在肝细胞中转录的ｍRNA长度约是小
肠细胞中转录的ｍRNA长度的2倍；
C、apoB－100蛋白质和apoB－50蛋白质有50个氨基酸完全一样；
D、apoB－100蛋白质和apoB－50蛋白质都是a
poB基因的表达产物；
E、apoB－50蛋白质的产生是因为apoB基因在转录时发生选择性裁接的结果。
（5）科学家将人的生长激素基因导入大肠杆菌以获取人生长激素（如图二）。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC— ，限制酶II的识别序列和切点是—↓GATC—。
①目的基因可以通过 方法获取。
②重组质粒构建过程中需要用到的酶包括限制性内切酶和 酶。在DNA双链上，被限制性内切酶特异性识别（酶切位点处）的碱基序列特点是
。
③据图分析，在构建基因表达载体过程中，应选用 （限制酶I / 限制酶II）切割质粒，选择理由是 。
④成功导入该重组质粒的细菌能否生长在含四环素的培养基上？ ；能否生长在含抗氨苄青霉素素的培养基上？ ；根据此原理可完成转基因工程的筛选（工程菌）环节。
（6）如果某基因中的一个碱基发生突变，则突变基因控制合成的蛋白质与正常蛋白（正常基因控制合成）相比是否一定不同，并说明理由？ 。
应用生物工程技术可以获得人们需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题：
（1）转人生长激素基因牛可通过分泌的乳汁来生产人生长激素，在基因表达载体中，人生长激素基因的首端必须含有 。
（2）prG能激发细胞不断分裂，通过基因工程导入该调控基因来制备单克隆抗体，Ⅱ最可能是 细胞，Ⅲ代表的细胞具有
的特点。
（3）将携带外源基因的DNA导入动物受精卵细胞
中一般采用_______________方法。
（4）在抗虫棉的培育过程中，目的基因导入植物细胞后，是否能够正常转录，可以通过_______________技术来确定。导入目的基因的植物细胞一般需要通过________ 的方法，才能获得新性状的植株。
（5）通过基因工程，科学家已经培育出了许多具有全新性状的农作物，但也有人对转基因食品的安全性提出了质疑，试阐述你对这一问题的看法。（至少答出两点）
① ；
② 。
番茄营养丰
富，是人们喜爱的一类果蔬。但普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因，控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄软化，不耐贮藏。为满足人们的生产生活需要，科学家们通过基因工程技术，培育出了抗软化、保鲜时间长的番茄新品种。操作流程如图，请回答：
(1)过程①需要的工具酶有限制性内切酶和＿＿＿＿＿＿＿＿。限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸碱基序列。下图为四种限制酶BamHI，EcoRI，HindⅢ以及BglⅡ的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列为何？（ ）
| A．BamHI和EcoRI；末端互补序列—AATT— |
| B．BamHI和HindⅢ；末端互补序列—GATC— |
| C．EcoRI和HindⅢ；末端互补序列—AATT— |
| D．BamHI和BglII；末端互补序列—GATC— |
(2)在构建基因表达载体时，重组DNA中除插入目的基因外，还需要有＿＿＿＿、终止子以及＿＿＿＿＿＿＿＿。
(3)在番茄新品种的培育过程中，将目的基因导入受体细胞的方法叫做＿＿＿＿＿＿＿＿＿。在基因工程中把人的生长激素基因导入鼠受精卵的常用方法叫做＿＿＿＿＿＿＿。
(4)从图中可见，mRNAl和mRNA2的结合直接导致了＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿无法合成，最终使番茄获得了抗软化的性状。多聚半乳糖醛酸酶基因与抗多聚半乳糖醛酸酶基因是否为等位基因？＿＿＿＿。
科学家已成功将人a一抗胰蛋白酶基因导入山羊，可通过转基因山羊分泌的乳汁来产人
抗胰蛋白酶。培育该转基因山羊的基本过程如下：
（1）为了鉴别人抗胰蛋白酶基因是否导人山羊受精卵中，基因表达载体中须含有＿＿＿＿＿＿＿＿。
（2）将基因表达载体导入山羊受精卵的最常用有效的方法是＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3）山羊受精卵一般要培养到＿＿＿＿＿＿＿＿阶段，才能植入母体。
（4）早期胚胎植入母体的技术称为＿＿＿＿＿＿＿＿。
（5）要检测转基因山羊分泌的乳汁是否含有人抗胰蛋白酶，可采用＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿方法。
试题篮
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粤公网安备 44130202000953号
