“滔滔”是我国第一例转入人体白蛋白基因的转基因试管牛，人们利用该转基因奶牛的乳汁生产人类血清白蛋白。
（1）试管动物实际上是体外受精与胚胎移植两项技术的综合运用。体外受精前需要对奶牛的精子进行_________处理。防止多精入卵的生理反应包括____________和__________。胚胎工程的终端环节是胚胎移植，移植后的胚胎能在受体子宫内存活的生理基础是不发生_______________________。
（2）人体白蛋白基因通常可以从基因文库中获取，含有一种生物所有基因的文库称为____________，获得人体白蛋白基因后可以利用________技术进行扩增。人体白蛋白基因一般利用____________技术导入牛的受精卵中，当受精卵分裂到囊胚期时，需要取囊胚的____________细胞进行性别鉴定，以确保发育成熟的牛能分泌乳汁。
请分析下面一项专利。
| 申请专利号 |
03109739.1 |
时间 |
2003.04.14 |
| 名 称 |
利用转基因番茄生产胰岛素的方法 |
公开号 |
1458161 |
| 公开日 |
2003.11.26 |
申请（专利权） |
林忠平 |
| 地 址 |
北京市北京大学 生命科学学院 |
发明（设计人） |
林忠平、倪挺、 陈溪、胡鸢雷 |
| 专 利 摘 要 |
本发明利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素。所用的人胰岛素基因是依据植物偏爱密码子的原则来设计所含的密码子，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在C端加上KDEL的内质网滞留序列。将该基因置于CaMV35S启动子和果实专一性启动子2A12的驱动之下，通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素。 |
（1）此基因工程中，目的基因是 。将人工合成的DNA片段拼接在一起，所必需的工具酶是 。
（2）试分析在C端加上KDEL的内质网滞留序列的原因： 。
（3）农杆菌介导的方法是将目的基因与农杆菌的 结合构建 ；目的基因能否在番茄中稳定遗传的关键是 ；检测受体细胞中是否存在目的基因可采用 技术。
自然界中能够产生生物荧光的酶的统称为荧光素酶。荧光素酶及其合成基因在生物研究中有着广泛的利用。
（1）荧光素酶基因常被作为基因工程中的标记基因，其作用是将__________________筛选出来。
（2）下表为4种限制酶的识别序列和酶切位点，右下图为含有荧光素酶基因的DNA片段及其具有的限制酶切点。若需利用酶切法（只用一种酶）获得荧光素酶基因，最应选择的限制酶是____________。
（3）利用PCR技术扩增荧光素酶基因是利用________________的原理，使荧光素酶基因数量呈______________方式增加。
（4）迄今为止，可将上述具有荧光素酶基因的运载体导入动物细胞的技术，应用最多的、最有效的是________________。经一系列步骤，将所获得的胚胎早期培养一段时间后，再移植到雌性动物的____________或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。
（5）囊胚阶段的胚胎进行胚胎分割，可以提高胚胎的利用率，但在进行分割时应注意____________________________。
（6）荧光素酶在ATP的参与下，可使荧光素发出荧光。生物学研究中常利用“荧光素一荧光素酶发光法”来测定样品中ATP的含量。某研究小组对“测定ATP时所需荧光素酶溶液的最佳浓度”进行了探究。
[实验材料]1×10－8mol／L ATP标准液、缓冲溶液、70 mg／L荧光素溶液（过量）、浓度分别为10、20、30、40、50、60、70 mg／L的荧光素酶溶液。
[实验结果]见下图。
[实验分析与结论]
①实验过程：为使结果更加科学准确，应增设一组___________________________作为对照。除题目已涉及的之外，还需要严格控制的无关变量有__________（至少写出一个）。
②实验结果：由图C可知，____________点所对应的荧光素酶浓度为最佳浓度。
（7）食品卫生检验中，可利用上述方法测定样品中细菌的ATP总含量，进而测算出细菌的数量，判断食品污染程度。测算的前提是每个细菌细胞中ATP的含量____________。
毛角蛋白Ⅱ型中间丝（KIFⅡ）基因与绒山羊的羊绒质量密切相关。获得转KIFⅡ基因的高绒质绒山羊的简单流程如图。
（1）过程①是基因工程的核心，通过过程①构建的基因表达载体除了含有KIFⅡ基因外，还必须有启动子、终止子以及 等。
（2）过程②必需加入 酶，才能获得单个的成纤维细胞。
（3）在过程③中，为了获得更多的卵（母）细胞，需用 处理成年母绒山羊。
（4）在过程④进行之前，需对卵（母）细胞进行 处理。过程④称为 。
（5）过程⑤称为 ，进行该过程的最佳时期是 ，过程⑤能够成功进行的生理基础是 。
下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答：
（1）在基因工程中，A表示目的基因的获取，通过PCR技术可大量产生，PCR技术的原理是： ，B表示构建的基因表达载体，其组成除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及 等，其中启动子是 酶识别和结合的部位。
（2）B→C为转基因绵羊的培育过程，其中②过程常用的方法是 ，使用的绵羊受体细胞为 ，④用到的生物技术主要有动物细胞培养和 。
（3）B→D为转基因抗虫棉的培育过程，其中③过程常用的方法是 ，⑤过程的原理是 ，要确定目的基因（抗虫基因）导入受体细胞后，在棉花细胞中是否成功表达，从分子水平上鉴定可以用采用的方法是 。
请回答下列有关胚胎工程和基因工程方面的问题：
（1）目前，科学家通过细胞核移植实验，培育出多种哺乳动物新类型。在哺乳动物的核移植实验中，一般通过 （物理方法）将受体细胞激活，使其进行细胞分裂并发育，当胚胎发育到 阶段时，将胚胎植入另一雌性（代孕）动物体内。
（2）在“试管牛”的培育过程中，要使精子和卵母细胞在体外成功结合，需要对精子进行 处理。另外，培养的卵母细胞需要发育至 ，该时期在显微镜下可观察到次级卵母细胞和第一极体。
（3）利用体细胞进行核移植技术的难度明显高于利用胚胎细胞进行核移植的原因是 。
（4）若要使获得的转基因牛分泌的乳汁中含有人干扰素，则所构建的基因表达载体必须包括：某种牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子、 、终止子、标记基因和复制原点等。目前常用的措施是将该基因表达载体导入牛的 （填“受精卵”或“乳腺细胞”）。导入方法是 。
人α-1-抗胰蛋白酶是治疗先天性肺纤维化囊肿、肺气肿以及呼吸窘迫综合症、特异性皮炎等疾病的特效药物。2001年，我国首例4只转有人α-1-抗胰蛋白酶的转基因羊在北京顺义诞生，填补了我国α-1-抗胰蛋白酶药物市场的空白。根据题意回答下列问题：
（1）在体外，构建人α-1-抗胰蛋白酶基因的表达载体时，用到的工具有 。
（2）采用 法将构建好的基因表达载体导入受精卵，然后将受精卵移入 中继续培养得到早期胚胎，然后将其移植入受体母体的子宫。
（3）对胚胎进行性别鉴定、获得同卵双胎都需对胚胎进行分割，二者分割的不同之处在于：对胚胎进行性别鉴定时， ；若获得同卵双胎，则需 。
（4）检测人α-1-抗胰蛋白酶基因是否插入到染色体上，可从分子水平上检测，方法是 。
（5）在掌握培育转基因羊技术之前，生产人α-1-抗胰蛋白酶常用的方法是细胞工程或发酵工程。培育出转基因羊后，可以在羊奶或羊尿中分离出该药物。与此相比，试述细胞工程或发酵工程的不足之处。 。
科学家将绿色荧光蛋白(GFP)基因转入小鼠胚胎干细胞(ES)内，GFP基因表达就会使细胞带有绿色荧光的，继而利用带有绿色荧光的ES细胞培育出嵌合型的小鼠用于科学研究，流程如下图。请回答：
（1）在步骤①中，若绿色荧光蛋白(GFP)基因是cDNA片段，则在GFP基因的上游必须加入_____________，该核苷酸序列是_____________酶识别和结合的部位。
（2）步骤②的受体细胞是小鼠ES细胞，ES细胞一般从囊胚的_______________分离得到。在培养ES细胞时，细胞充满培养皿底部后停止分裂，这种现象称为_______________。
（3）为获取更多卵母细胞，首先要对供体母鼠注射促性腺激素，使其____________，然后可用人工方法从小鼠输卵管内获得，该过程称为__________________。
（4）图中重组囊胚在步骤⑤之前要先检测是否有_______________，再通过_________________技术移入代孕母鼠子宫内继续发育。
（1）基因工程的核心步骤是________________。图甲是基因表达载体的模式图，图中插入基因和抗生素抗性基因分别作为基因工程中的___________________基因。
（2）模型是人们为了某种特定目的对认识的对象所做的一种简化的概括性描述，模型构建是生物学教学、研究和学习的一种重要方法。图乙是基因工程的操作流程图，图中C和D可分别表示_____________。若图乙表示单克隆抗体制备过程，则从A、B到C的过程需要的生物方法是使用___________________。
（3）有人提出用细胞核移植技术构建重组细胞来生产单克隆抗体，试用相关的图示及文字（括号中填文字）完善图丙表示该过程：
（4）高等哺乳动物受精后不久，受精卵开始进行细胞分裂。经桑椹胚、囊胚、原肠胚和组织器官的分化，最后发育成一个完整的幼体，完成胚胎发育的全过程。图中②、③依次为_________，胚胎从①中伸展出来的过程叫做____________。若要对图所示胚胎进行胚胎分割，则正确的操作方法的是图中的_________。
P5CS是植物合成脯氨酸的关键酶，脯氨酸有助于植物抵御干旱。下图是将P5CS基因转入烟草细胞获得耐旱烟草植株过程的示意图。
请回答:
（1）要将P5CS基因成功插入Ti质粒中，Ti质粒的 中应含有HindⅢ、SalⅠ限制酶切割位点。③过程需在农杆菌的培养基中添加 才能筛选出含P5CS基因的Ti质粒的农杆菌。
（2）检测P5CS基因是否整合到烟草细胞染色体DNA上，采用 技术，转基因是否成功可以直接在个体水平上对转基因植物与非转基因植物的 性进行比较。
（3）将转入P5CS基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用 技术，愈伤组织通过 发育成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加 。
如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。请回答：
（1）A→B利用的技术称为 ，其中②过程需要热稳定的 酶才能完成。
（2）图中将目的基因导入棉花细胞需要经过C过程，该过程为构建 ，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代，并能表达。
（3）上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是 法，该方法一般 （填“适宜”或“不适宜”）用于将目的基因导入单子叶植物。
（4）从F→G的过程利用的主要技术为 ，欲确定抗虫基因在G体内是否表达，在个体水平上需要做 实验。如果抗虫基因导入成功，且与一条染色体的DNA整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交，预计后代中抗虫植株占
猪的基因和人类的基因存在一定的相似度。据报道经特殊处理的猪皮可在人身上存活3周左右，起保护创面免受感染的作用。移植猪皮后，还要在猪皮上开很多小口，在小口处植入患者的自体皮肤组织，自体皮肤慢慢生长，逐渐覆盖原先创面，而猪皮最终会掉光。为了使移植的猪皮存活更长时间，有人设法导入人的相关基因（用P表示），获得转基因小白猪。其简要流程如下图所示：
据图中信息并结合课本知识回答：
（1）过程①中形成重组DNA常用的酶有限制性核酸内切酶和 ；将目的基因导入成纤维细胞常用的方法是 。
（2）过程②中，常用 酶处理，将皮肤组织块分散成单个成纤维细胞。在培养成纤维细胞时需要满足的条件是无菌、无毒、通气、适宜的温度、pH以及 。
（3）图中的卵母细胞应在体外培养到 ，并作除去细胞核的处理；过程③中所用的技术是 ；能代替图中卵母细胞的还可以是 。
（4）移植后的胚胎能在受体子宫中存活的生理基础是 。
(10分)请回答下列有关基因工程的问题。
下表是基因工程中几种限制酶识别序列及其切割位点。图是转基因香蕉的培育过程，含目的基因的外源DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。
（1）从转基因香蕉培育图中反映了质粒作为运载体的特点是___________________________，基因工程中还可以用___________________作为运载体。
（2）图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用SmaI酶切割，原因是_________________。
（3）下图是用_________________(限制）酶进行切割得到的目的基因。可以防止含目的基因的外源DNA片段切割后自身环化。
（4）人体细胞内含有抑制癌症发生的某基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。该基因含有800对碱基对(bp)，用BamHⅠ切割得到的400bp，200bp，200bp,.用EcoRⅠ再次切割得到100bp,300bp,150bp，50bp,200bp.而患者体内获取的这段基因，用BamHⅠ切割得到的区段变为400bp，400bp ，用EcoRⅠ再次切割得到100bp,300bp,150bp，250bp.在正常人体内BamHⅠ和EcoRⅠ识别序列分别有________个和_____个，患者体内发生了_________。
（5）下列有关基因工程的叙述错误的是（ ）（多选）
| A．质粒上的目的基因必须整合到受体细胞的DNA上才能不被分解 |
| B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同 |
| C．没有与目的基因重组的质粒也可以进入受体细胞 |
| D．质粒上的抗生素抗性基因有利于质粒与外源基因连接 |
回答下列有关现代生物科技方面的问题：
（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生________末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，一般选择能使二者产生___________(相同、不同)黏性末端的限制酶。
（2）在精卵结合过程中，防止多精入卵的第二道屏障称做： 。
（3）生态经济：使一个系统产出的污染物，能够成为本系统或另一个系统的生产原料，从而实现废弃物的资源化。“无废弃物农业”体现了生态工程 原理。
（4）若要获取转基因植物人工种子，需培养到_______________阶段，再进行人工种皮的包裹；如用植物细胞实现目的基因所表达的蛋白质类药物的工厂化生产，培养到_______________阶段即可。
（5）动物克隆技术：目前动物的克隆主要采用__________________技术来实现，我国禁止生殖性克隆，但不反对________________的研究。
回答下列有关基因工程的问题。
为扩大耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。图1为几种限制酶识别序列及其切割位点，图2为耐盐基因的部分序列，图3、图4中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
（1）下列A-D所示的黏性末端是由 种限制性内切酶作用产生的,其中 所示粘性末端为用EcoRⅠ酶切后所得。
（2）图4中限制性核酸内切酶作用于图2中的 （填“a”或“b”）处，其特异性表现为 。如同时用EcoRⅠ和HindⅢ酶切外源DNA，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是 。
（3）构建重组质粒时，如同时使用EcoRⅠ和HindⅢ酶，则可以形成 种重组质粒。
（4）如图2耐盐基因的片段序列可控制合成 “—脯氨酸—谷氨酸—谷氨酸—赖氨酸—”的氨基酸序列，则翻译上述多肽的mRNA是由该基因的________链转录的。（以图中①或②表示）（脯氨酸的密码子是：CCU、CCC、CCA、CCG；谷氨酸的是GAA、GAG；赖氨酸的是AAA、AAG。）
（5）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是
和 。
（6）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
试题篮
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