高中生物实验题

某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。

（1）限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________。

（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________。

（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________。

（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________（答出2点即可）。

为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒 $P_0$，构建重组质粒 $P_x$，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1~4结合位置如图所示，→表示引物5＇→3＇方向）。回答下列问题：

（1）PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是________，而PCR过程中解开双链的方法是________。

（2）PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有________。

（3）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：________；②无扩增产物，原因是________；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是________。

（4）设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果。

甜瓜幼果果皮有深绿色和浅绿色之分。为探究甜瓜幼果果皮颜色的遗传规律，科研人员进行了相关研究。回答下列问题：

（1）幼果果皮颜色由4号染色体上的等位基因A/a控制。将深绿色甜瓜与浅绿色甜瓜杂交， $F_1$ 幼果为深绿色， $F_1$ 自交后， $F_2$ 深绿色幼果中纯合子所占的比例为＿＿＿＿＿＿。

（2）研究发现，基因M与甜瓜幼果的叶绿素积累有关，蛋白A能通过与基因M的启动子结合来增强基囚M的表达。测序结果表明，果皮浅绿色基因a是由基因A突变而成，相关信息如图所示。

①据图分析，与蛋白A相比，蛋白a发生的变化是＿＿＿＿＿＿，判断依据是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

②结合上述研究结果，解释甜瓜幼果浅绿色果皮形成的原因＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（3）已知甜瓜果皮有条纹基因B与无条纹基因b也位于4号染色体上。现有两个纯合甜瓜品种：幼果深绿色无条纹和幼果浅绿色有条纹，设计一个杂交实验证明控制甜瓜果皮两对性状的基因位于同一对染色体上。（用遗传图解表示，不考虑染色体互换）

脂滴是存储和转运脂肪的细胞器。脂肪酸和甘油合成脂肪存储于脂滴中。糖类代谢异常时，脂肪可分解为脂肪酸为机体供能。为研究脂肪酸供能的转运路径，科研人员让小鼠成纤维细胞摄入红色荧光标记的外源脂肪酸后，分别置于细胞培养液和无机盐缓冲液中培养，用绿色荧光、蓝色荧光分别标记细胞的脂滴和线粒体，分析荧光重合程度，结果如图所示。

回答下列问题：

（1）用无机盐缓冲液培养的目的是使细胞处于营养匮乏状态，动员______为细胞供能。

（2）据图分析，标记的脂肪酸能被细胞吸收并存储于脂滴中，依据是______；在无机盐缓冲液培养的细胞中，脂肪酸的转运路径是______。

（3）实验结果发现，在一定时间内，无机盐缓冲液培养的细胞中脂滴的数量增加。推测脂滴中的脂肪酸来源与溶酶体参与的细胞自噬有关，理由是______。

欲为该推测提供实验证据，利用小鼠成纤维细胞和3-MA（一种自噬抑制剂）为材料设计实验，完善实验思路并写出支持推测的预期结果。

①实验思路：对照组的小鼠成纤维细胞置于______中培养；实验组的小鼠成纤维细胞置于______中培养。一段时间后，观察并比较两组______。

②预期结果：______。

（4）在营养匮乏状态下，有些细胞的细胞质基质中会出现游离脂肪酸的过量堆积，导致脂毒性的发生。从脂肪酸转运路径的角度推测，细胞出现脂毒性的原因是______（答出1点）。

为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。

回答下列问题：

（1）大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素＿＿＿＿＿＿的平板（含有X-gal）上进行培养。若长出的是＿＿＿＿＿＿色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。

（2）Cas9基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5种启动子（A、B、C、D和E）启动Cas9的转录，相应检测结果如图2所示。结果表明，启动子＿＿＿＿＿＿对细胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子＿＿＿＿＿＿用于该系统。

（3）含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。

①培养12小时后，图3试管1中大部分的大肠杆菌＿＿＿＿＿＿（填选项）。

A. 含质粒1和质粒2B. 只含质粒1

C. 只含质粒2D. 无质粒1和质粒2

②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

玉米是我国栽培面积最大的农作物，籽粒大小是决定玉米产量的重要因素之一，研究籽粒的发育机制，对保障粮食安全有重要意义。

（1）研究者获得矮秆玉米突变株，该突变株与野生型杂交， $F_1$ 表型与___________相同，说明矮秆是隐性性状。突变株基因型记作rr。

（2）观察发现，突变株所结籽粒变小。籽粒中的胚和胚乳经受精发育而成，籽粒大小主要取决于胚乳体积。研究发现，R基因编码DNA去甲基化酶，亲本的该酶在本株玉米所结籽粒的发育中发挥作用。突变株的R基因失活，导致所结籽粒胚乳中大量基因表达异常，籽粒变小。野生型及突变株分别自交，检测授粉后14天胚乳中DNA甲基化水平，预期实验结果为__________________。

（3）已知Q基因在玉米胚乳中特异表达，为进一步探究R基因编码的DNA去甲基化酶对Q基因的调控作用，进行如下杂交实验，检测授粉后14天胚乳中Q基因的表达情况，结果如表1。

综合已有研究和表1结果，阐述R基因对胚乳中Q基因表达的调控机制。

（4）实验中还发现另外一个籽粒变小的突变株甲，经证实，突变基因不是R或Q。将甲与野生型杂交， $F_1$ 表型正常， $F_1$ 配子的功能及受精卵活力均正常。利用 $F_1$ 进行下列杂交实验，统计正常籽粒与小籽粒的数量，结果如表2。

已知玉米子代中，某些来自父本或母本的基因，即使是显性也无功能。

①根据这些信息，如何解释基因与表2中小籽粒性状的对应关系？请提出你的假设。

②若 $F_1$自交，所结籽粒的表型及比例为____________，则支持上述假设。

当某品种菠萝蜜成熟到一定程度，会出现呼吸速率迅速上升，再迅速下降的现象。研究人员以新采摘的该菠萝蜜为实验材料，测定了常温有氧贮藏条件下果实的呼吸速率和乙烯释放速率，变化趋势如图。回答下列问题：

（1）菠萝蜜在贮藏期间，细胞呼吸的耗氧场所是线粒体的______，其释放的能量一部分用于生成______，另一部分以______的形式散失。

（2）据图可知，菠萝蜜在贮藏初期会释放少量乙烯，随后有大量乙烯生成，这体现了乙烯产生的调节方式为______。

（3）据图推测，菠萝蜜在贮藏5天内可溶性糖的含量变化趋势是______。为证实上述推测，拟设计实验进行验证。假设菠萝蜜中的可溶性糖均为葡萄糖，现有充足的新采摘菠萝蜜、仪器设备（如比色仪，可用于定量分析溶液中物质的浓度）、玻璃器皿和试剂（如DNS试剂，该试剂能够和葡萄糖在沸水浴中加热产生棕红色的可溶性物质）等。简要描述实验过程：

①______________________________；

②分别制作匀浆，取等量匀浆液；

③______________________________；

④分别在沸水浴中加热；

⑤______________________________。

（4）综合上述发现，新采摘的菠萝蜜在贮藏过程中释放的乙烯能调控果实的呼吸速率上升，其原因是____________。

百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：

（1）体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用_______去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用_______（填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。

（2）单倍体育种。常用________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是________。

（3）基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码CUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。

①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用_______酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导人烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中________的诱导作用最强。

②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路________。

驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。

回答下列问题：

（1）研究者优化了培养基的_______（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。

（2）研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________，理由是___________。

（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为________________________（答两点）。

（4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____。

（5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路______。

基因工程：制备新型酵母菌

（1）已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是＿＿＿＿＿。（填“细胞内”和“细胞外”）

（2）同源切割是一种代替限制酶、 $DNA$连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列 $A﹣B$，已知酵母菌体内 $DNA$有许多 $A﹣B$序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图甲，则应选择图中的引物＿＿＿＿＿对目的基因进行 $PCR$。

（3）已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（ $UGA$）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使 $5﹣$氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。

（i）导入目的基因的酵母菌应在＿＿＿＿＿的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除 $UGA$基因，再重新导入。研究人员在 $UGA$基因序列两端加上酵母菌 $DNA$中不存在的同源 $C.C\prime$序列，以便对 $UGA$基因进行切除。 $C.C\prime$的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定 $DNA$片段在切割后是否可以顺利重连，如图乙，则应选择方式＿＿＿＿＿进行连接。

（ii）切去 $UGA$基因的酵母菌应在＿＿＿＿＿的培养基上筛选培养。

（4）综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图丙中的图＿＿＿＿＿。

某种观赏植物的花色有红色和白色两种。花色主要是由花瓣中所含色素种类决定的，红色色素是由白色底物经两步连续的酶促反应形成的，第1步由酶 $1$催化，第2步由酶 $2$催化。其中酶1的合成由 $A$基因控制，酶 $2$的合成由 $B$基因控制。现有甲、乙两个不同的白花纯合子，某研究小组分别取甲、乙的花瓣在缓冲液中研磨，得到了甲、乙花瓣的细胞研磨液，并用这些研磨液进行不同的实验。

实验一：探究白花性状是由 $A$或 $B$基因单独突变还是共同突变引起的

①取甲、乙的细胞研磨液在室温下静置后发现均无颜色变化。

②在室温下将两种细胞研磨液充分混合，混合液变成红色。

③将两种细胞研磨液先加热煮沸，冷却后再混合，混合液颜色无变化。

实验二：确定甲和乙植株的基因型

将甲的细胞研磨液煮沸，冷却后与乙的细胞研磨液混合，发现混合液变成了红色。

回答下列问题。

（1）酶在细胞代谢中发挥重要作用，与无机催化剂相比，酶所具有的特性是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿（答出3点即可）；煮沸会使细胞研磨液中的酶失去催化作用，其原因是高温破坏了酶的＿＿＿＿＿＿＿。

（2）实验一②中，两种细胞研磨液混合后变成了红色，推测可能的原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（3）根据实验二的结果可以推断甲的基因型是＿＿＿＿＿＿＿，乙的基因型是＿＿＿＿＿＿＿；若只将乙的细胞研磨液煮沸，冷却后与甲的细胞研磨液混合，则混合液呈现的颜色是＿＿＿＿＿＿＿。

科研人员构建了可表达 $J﹣V5$融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中 $V5$编码序列表达标签短肽V5。

（1）与图甲中启动子结合的酶是＿＿＿＿＿＿。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿（答出2个结构即可）。

（2）构建重组质粒后，为了确定 $J$基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行 $PCR$检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物＿＿＿＿＿＿。已知 $J$基因转录的模板链位于b链，由此可知引物 $F1$与图甲中J基因的＿＿＿＿＿＿（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。

（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗 $J$蛋白抗体和抗 $V5$抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带 $1$证明细胞内表达了＿＿＿＿＿＿，条带 $2$所检出的蛋白＿＿＿＿＿＿（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。

微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：

（1）根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为___________。

（2）本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。

①选用___________酶将载体P切开，再用___________（填"T ₄DNA或"E·coli81DNA"）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。

②载体P′不具有表达MT基因的___________和___________。选用___________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用___________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。

（3）MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是___________。

长期酗酒会使肠道E球菌大量滋生，影响肠道菌群的组成，同时还会增加肠道壁的通透性，导致肠道细菌及其产物向肝脏转移，引起肝脏炎症。根据能否分泌外毒C（一种蛋白质毒素），可将E球菌分为E ⁺（分泌外毒素C）和E ^-（不分泌外毒素C）。回答下列问题：

（1）科研人员对携带E ⁺和E ^-球菌的酒精性肝炎临床重症患者的生存率进行统计结果如图1所示。推测外毒素C___________（填"会"或"不会"）加重酒精性肝炎病情。

（2）为进一步探究外毒素C与酒精性肝炎的关系，科研人员进行了相关实验。

I.体外实验将分离培养的无菌小鼠肝脏细胞等分为A、B两组。在A组的培养液中加入外毒素C，B组的培养液中加入等量的生理盐水，培养相同时间后，检测肝脏细胞的存活率。若实验结果为___________，则可以推测外毒素C对体外培养的小鼠肝脏细胞具有毒性作用。

Ⅱ.体内实验:将无菌小鼠分为6组进行相关实验，检测小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）的水平（ALT水平越高，肝脏损伤越严重）及统计肝脏E球菌的数量。实验分组和结果如图2所示。

①结果表明外毒素C能加重实验小鼠酒精性肝炎症状，灌胃I和Ⅱ的实验材料分别选用__________和__________。

A.生理盐水B.E ⁺菌液C.E ^-菌液D.灭活的E ⁺菌液E.灭活的E ^-菌液

②根据图2结果，外毒素C__________（填"会"或"不会"）影响实验小鼠肠道壁通透性，判断依据是__________。

（3）目前尚无治疗酒精性肝炎的特效药。在上述研究的基础上，科研人员还利用专门寄生于E球菌的噬菌体有效治疗了酒精性肝炎模型小鼠，该实验的研究意义是__________。

某一年生植物甲和乙是具有不同优良性状的品种，单个品种种植时均正常生长。欲获得兼具甲乙优良性状的品种，科研人员进行杂交实验，发现部分F ₁植株在幼苗期死亡。已知该植物致死性状由非同源染色体上的两对等位基因（A/a和B/b）控制，品种甲基因型为aaBB，品种乙基因型为_ _bb。回答下列问题:

（1）品种甲和乙杂交，获得优良性状F ₁的育种原理是___________。

（2）为研究部分F ₁植株致死的原因，科研人员随机选择10株乙，在自交留种的同时，单株作为父本分别与甲杂交，统计每个杂交组合所产生的F ₁表现型，只出现两种情况，如下表所示。

甲（母本）	乙（父本）	F 1
aaBB	乙-1	幼苗期全部死亡
	乙-2	幼苗死亡:成活=1:1

①该植物的花是两性花，上述杂交实验，在授粉前需要对甲采取的操作是___________、___________。

②根据实验结果推测，部分F ₁植株死亡的原因有两种可能性:其一，基因型为A_B_的植株致死；其二，基因型为___________的植株致死。

③进一步研究确认，基因型为A_B_的植株致死，则乙-1的基因型为___________。

（3）要获得全部成活且兼具甲乙优良性状的F ₁杂种，可选择亲本组合为:品种甲（aaBB）和基因型为___________的品种乙，该品种乙选育过程如下:

第一步:种植品种甲作为亲本

第二步:将乙-2自交收获的种子种植后作为亲本，然后___________统计每个杂交组合所产生的F ₁表现型。

选育结果:若某个杂交组合产生的F全部成活，则___________的种子符合选育要求。